Корзина
14 отзывов
Медицинские расходные материалы - «Медлаб»
+79134877738
+79133749595
+79538013785
Корзина
  • ООО "Медлаб"
  • Полезная информация
  • Подготовка образцов для определения общих иммуноглобулинов классов G, M, A в сыворотке крови и в других биологических жидкостях человека методом ИФА

Подготовка образцов для определения общих иммуноглобулинов классов G, M, A в сыворотке крови и в других биологических жидкостях человека методом ИФА

Подготовка образцов для определения концентрации общих иммуноглобулинов классов G, M, A в сыворотке крови и в других биологических жидкостях человека методом ИФА
Решетников С.С. (АО «Вектор-Бест»)

Определение общих иммуноглобулинов классов G, М, А, а также секреторного IgA давно и прочно вошло в практику клинико-диагностических лабораторий и широко используется как для контроля иммунного статуса, так и в комплексной диагностике ряда патологий.

Для определения иммуноглобулинов в на стоящее время преимущественно используют три метода: радиальную иммунодиффузию по Манчини, турбидиметрию и иммуноферментный анализ (ИФА). Каждый из этих методов имеет свои достоинства и недостатки. Так, классический метод Манчини, пожалуй, самый наглядный и простой, но и самый продолжительный (1–4 суток). Кроме того, его можно отнести к «количественным» методам (особенно по границам рабочего диапазона концентраций) только с очень большой натяжкой. Точность анализа иммуноглобулинов (особенно IgM) сильно зависит от качества агарозного геля с антителами. Например, при подсыхании геля скорость диффузии резко замедляется, а сама она развивается неравномерно, что значительно затрудняет оценку результатов исследования.

К недостаткам метода Манчини относится также визуальная оценка результатов анализа, которая может быть в высшей степени субъективна. Например, концентрация иммуноглобулинов, определенная разными операторами в одном и том же образце и с использованием наборов одной и той же серии, может различаться в 1,5–3 раза! В более современных методах ИФА и турбидиметрии применяется инструментальный учет результатов. Эти методы позволяют проводить количественный анализ иммуноглобулинов с высокой точностью, а выбор одного или другого из них зависит в основном от оснащения лаборатории. Впрочем, ИФА благодаря более высокой чувствительности обладает очевидными преимуществами при определении низких концентраций иммуноглобулинов (например, не в сыворотке крови, а в других биологических жидкостях и средах).

АО «Вектор-Бест» предлагает наборы реагентов для иммуноферментного определения концентрации общих иммуноглобулинов классов G, M, A и E, а также секреторного IgA и подклассов IgG. Эти наборы могут быть использованы для проведения ИФА как в ручном режиме, так и на автоматических анализаторах. Иммуноферментный метод удобен, прост и воспроизводим, однако из-за его высокой чувствительности и вследствие относительно высоких концентраций иммуноглобулинов в сыворотке крови возникают повышенные требования к качеству исследуемого образца, а также к подготовке его рабочего разведения для анализа. Концентрации общих иммуноглобулинов в сыворотке крови и в других биологических жидкостях (БЖ) могут достигать нескольких десятков мг/мл. В то же время рабочий диапазон концентраций, измеряемый современными методами ИФА, варьирует для разных аналитов от нескольких мкг/мл до нг/мл. Иными словами, для опредения концентрации иммуноглобулинов в таких образцах БЖ их необходимо развести в тысячи раз! В первую очередь это относится к общему IgG, концентрация которого особен но высока в сыворотке крови. Однако с увеличением степени разведения исходного образца при его подготовке для ИФА cущественно возрастает вероятность ошибок. Во время этой процедуры требуются максимальное внимание, аккуратность и строгое следование инструкции. 

 


Хранение образцов для анализа

Для определения концентрации общих иммуноглобулинов обычно могут быть использованы как свежие образцы БЖ (после соответствующей первичной обработки, если она предусмотрена), так и образцы после хранения в холодильнике при температуре от +2 до +10ºС или в морозильной камере при температуре –20ºС. Образцы БЖ допускается хранить в холодильнике не более одной недели, а в морозильной камере – не более 1 года при условии, что они не подвергаются повторно процедуре замораживания/размораживания. Более детально условия хранения и предобработки образцов БЖ для анализа описаны в инструкциях к соответствующим наборам реагентов. Пробирка с образцом БЖ должна храниться вертикально и закрываться герметично. При хранении пробирки на боку или в перевернутом состоянии часть раствора может вытечь или потеряться в результате испарения на кромке крышки. 

Объем сосуда для хранения не должен превышать объем образца более чем в 3 раза. Чем больше свободный объем сосуда, тем активнее происходит испарение жидкости. При недостаточно герметичной крышке жидкость в пробирке постепенно испаряется, а концентрация аналита в образце возрастает (даже в морозильной камере!). В герметичном сосуде пары жидкости обычно конденсируются на стенках и крышке сосуда в виде капель (в холодильнике) или инея (в морозильной камере). Если этот конденсат не возвратить в образец перед проведением исследования, результаты определения аналита в образце будут завышены. С другой стороны, при очень большом свободном объеме сосуда из паров воды, которые присутствовали в воздухе в момент закрывания крышки сосуда, может образоваться дополнительный конденсат. Эта часть конденсата при возвращении в раствор может увеличить первоначальный объем образца и снизить концентрацию измеряемого аналита. Таким образом, для хранения образцов БЖ следует использовать только герметично закрывающуюся посуду минимального объема. 

Для того, чтобы быть уверенным, что концентрация аналита в образце при хранении не изменилась, полезно записывать его исходный объем на флаконе/пробирке с БЖ или в специальном журнале и (после возвращения конденсата в основной раствор) контролировать объем образца непосредственно перед анализом. Чрезвычайно трудно учесть все факторы, влияющие на изменение БЖ в образце в процессе хранения, поэтому, если есть возможность, лучше всегда анализировать свежие образцы!

 


Подготовка образцов для анализа

1. Пробирку с анализируемым образцом вынуть из холодильника, встряхнуть или центрифугировать, чтобы капли конденсата со стенок и крышки пробирки смешались с основной частью объема образца. Если образец был заморожен, то его (не открывая!) нужно предварительно разморозить при комнатной температуре. Пробирку с полученным раствором следует энергично встряхнуть или центрифугировать для объединения капель конденсата с основным объемом образца. 

2. Если образец выглядит однородным, не содержит видимых примесей и не имеет постороннего неприятного запаха, то его можно считать пригодным для анализа без дополнительной обработки. При наличии несвойственного данной БЖ запаха, который обычно является следствием бактериальной либо грибковой контаминации, образец бракуют и утилизируют. Мутный или содержащий видимый осадок образец подвергают очистке центрифугированием или фильтрацией, например, через шприцевой одноразовый фильтр. 

3. В результате длительного хранения или после процедуры замораживания/размораживания в образцах сыворотки (и особенно плазмы) крови с высоким содержанием липидов, жиров и фибриногена может образовываться желеобразный сгусток (гель), который не удаляется центрифугированием. Если этот гель составляет не более 1/3 объема образца, а повторный забор пробы затруднителен, можно попытаться отделить жидкую фазу образца от геля и использовать ее для анализа. Иногда удалить гель из образца удается механическим путем, например, подцепив гель кончиком наконечника для пипеток. Можно попытаться перенести пипеткой БЖ без геля в другую пробирку. Если от геля избавиться не удается, то образец бракуют.

4. Перед анализом образец следует довести до комнатной температуры и хорошо перемешать на вортексе или пипетированием, по возможности не допуская образования пены. Качество перемешивания имеет особенно важно значение для размороженных образцов, так как в них образуется градиент плотности раствора и, следовательно, градиент концентрации  иммуноглобулинов. Применяемый для пипетирования наконечник не используют затем для отбора аликвоты, а сбрасывают в дезраствор.

5. Пена в образце может серьезно искажать результаты анализа по следующим причинам:
    а) растворы БЖ при наличии пены быстрее высыхают и концентрация аналита в них возрастает;
    б) концентрация аналита в самой пене обычно тоже выше, чем в основной части раствора;
    в) белки в пене могут быстрее денатурировать, агрегировать, распадаться на субъединицы или процессировать, изменяя при этом свои иммунохимические свойства;
    г) попадание пены в наконечник пипетки занижает результаты анализа, поскольку в наконечнике остается меньше места для образца;
    д) пена, прилипшая к внешней стенке наконечника пипетки, может завысить результат анализа, поскольку при пипетировании с этой пеной в раствор может попасть дополнительное количество аналита;
    е) при вспенивании и при разрушении пены образуются аэрозоли, которые могут контаминировать другие исследуемые образцы и окружающую среду.

    Для минимизации потенциальных искажений результатов анализа рекомендуется использовать указанные ниже приемы работы с пипеткой.

 


Техника пипетирования при подготовке рабочих разведений образцов БЖ для анализа

1. Перед началом работы автоматические пипетки (дозаторы), образцы БЖ и раствор для разведения образца (РРО) доведите до комнатной температуры.

2. Используйте только оригинальные наконечники, применяйте фильтры для дозаторов и наконечники с фильтрами.

3. При надевании наконечника на пипетку, а также в процессе работы не прикасайтесь к рабочей поверхности наконечника руками или посторонними предметами.

4. Пипетируйте растворы плавно, не допуская образования пены.

5. Во время набора жидкости держите пипетку вертикально или под углом не более 15º от вертикали.

6. При наборе жидкости погружайте наконечник в БЖ или ее разведенный раствор на глубину не более 2 мм.

7. Если в образце имеется пена, старайтесь не погружать в нее наконечник пипетки.

8. После набора раствора снимайте с наконечника остаток жидкости и/или пену, слегка прижимая его на 1–2 сек к стенке сосуда выше уровня жидкости под углом 20–45º.

9. Перед набором образца БЖ или ее разведенного раствора смочите наконечник пипетки 3–5 раз раствором для разведения образца (РРО), затем снимите его остатки с наконечника, коснувшись стенки сосуда выше уровня РРО.

10. При наборе вязких образцов выдерживайте наконечник, погруженный в БЖ, 2–4 сек (время, достаточное для отбора пробы) и следите, чтобы в наконечник не попал пузырек воздуха или пена. После отбора образца слегка прижмите наконечник пипетки на 2–4 сек к стенке сосуда выше уровня БЖ для того, чтобы снять с наконечника избыток образца.

11. При подготовке рабочих разведений для анализа вносите БЖ по стенке сосуда, прикасаясь к ней наконечником под углом 20–45º в месте соприкосновения с РРО (при этом не следует погружать наконечник в жидкость более чем на 1,5 мм!). Вносите образец плавно, без дожима и последующего пипетирования. После внесения образца сбрасывайте наконечник и не используйте его для перемешивания. Полученный раствор объемом 0,5–10 мл перемешайте на вортексе, менее 0,5 мл – пипетированием с использованием чистого наконечника. Если разведение осуществляется в лунках дополнительного планшета, то раствор можно перемешать 10–30-кратным (в зависимости от вязкости раствора) пипетированием. При этом объем, забираемый пипеткой однократно, должен составлять не менее 1/10–1/30 объема перемешиваемого раствора.

Пипетирование особенно рекомендуется для перемешивания растворов с повышенной вязкостью. Методика перемешивания обычно оговаривается в инструкции к набору реагентов. Иногда применяют комбинированное перемешивание, когда одновременно перемешивают и пипетированием, и вращением наконечника, как ложкой в стакане. При перемешивании вращением наконечник пипетки не следует плотно прижимать ко дну и стенкам лунки планшета.

12. Наконечник, использованный для перемешивания или пипетирования БЖ, нельзя применять для приготовления растворов с меньшей концентрацией аналита.

13. Если предполагается многоступенчатое разведение, то пробу для каждого последующего разведения следует отбирать новым чистым наконечником, а само разведение осуществлять так, как описано выше. 

14. При внесении подготовленных образцов в лунки планшета для анализа следует соблюдать технику пипетирования, изложенную в п.п. 1–8, образец вносить в лунку планшета плавно по ее стенке (если в лунке имеется рабочий буферный раствор, после касания наконечником его поверхности).

 


Требования к автоматическим пипеткам, наконечникам, мерной посуде

• Пипетки должны своевременно проходить техническое обслуживание и поверку.
• Для получения адекватных результатов и продления срока службы пипетки ее следует использовать только с оригинальными или идентичными оригинальным наконечниками.
• Во избежание контаминации биологическим материалом и химическими реагентами рекомендуется использовать одноразовые наконечники с фильтрами (а сами пипетки регулярно очищать, подвергать санитарной обработке и также оснащать сменными фильтрами).
• Для хранения наконечников рекомендуется использовать специальные закрытые штативы с крышками.
• Не следует прикасаться руками к рабочей части наконечника пипетки, не следует прикасаться наконечником пипетки к внешним стенкам посуды и к другим предметам.
• Пипетки, наконечники, мерная посуда перед работой должны быть доведены до комнатной температуры.

 


Заключение

Как уже упоминалось выше, наибольшее количество ошибок возникает при определении концентрации IgG. В самом начале работы с соответствующими наборами такие ошибки чаще всего выражаются в массовом выявлении у пациентов аномально высоких значений этого иммуноглобулина, особенно в сыворотке или плазме крови, и в плохой воспроизводимости анализа. Возможно, это объясняется тем, что врачи-лаборанты, как правило, привыкли иметь дело со специфическими иммуноглобулинами, концентрация которых в БЖ по сравнению с общими иммуноглобулинами меньше в сотни и тысячи раз! В ИФА для определения специфических иммуноглобулинов образцы БЖ обычно используются без разведения или же разводятся однократно. При переходе к высоким степеням разведения БЖ даже у опытных операторов на результатах анализа начинает все более и более сказываться эффект суммирования мелких, казалось бы, совершенно незначительных погрешностей и недочетов.

Строгое соблюдение описанных здесь принципов хранения, подготовки и разведения БЖ для анализа позволит избежать типичных ошибок при количественном определении общих иммуноглобулинов методом ИФА. Это гарантирует правильные и воспроизводимые результаты, вопросы и претензии отпадают, и потребители по достоинству начинают ценить преимущества метода ИФА (например, в сравнении с методом радиальной иммунодиффузии по Манчини).

Другие статьи